学术速递肠道菌群或可成为肝癌早期诊断_青叶胆炮制

学术速递肠道菌群或可成为肝癌早期诊断

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导语

肝细胞癌（HCC）是全球癌症相关死亡的第四大原因，而慢性肝病和肝硬化是HCC发展的关键，常见的危险因素包括病毒性肝炎、酒精性肝病和非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）。新的数据支持定义肝硬化的微生物群特征，并与肝病严重程度的标志物相关。目前，科研工作者们正试图确定肝癌的微生物和代谢物特征，揭示肠道微生物群及其代谢物在肝癌发病机制中的作用。越来越多的证据表明，肝细胞癌的外周免疫反应影响疾病的临床进程、对治疗的反应和总生存率。

近期，澳大利亚悉尼新南威尔士大学的科研工作者在NatureCommunications杂志上发表了题为“Gutmicrobiotaimpactontheperipheralimmuneresponseinnon-alcoholicfattyliverdiseaserelatedhepatocellularcarcinoma”的研究。科研人员利用宏基因组与代谢组学技术对NAFLD相关的肝硬化合并/未见肝癌患者的肠道菌群进行分析，发现NAFLD-HCC患者的肠道菌群组成和功能都发生了改变，菌群中产短链脂肪酸细菌种类明显增加，其肠道菌群提取物在体外可诱导免疫抑制表型，这或与HCC患者较差的临床结果和免疫治疗耐药有关。本研究进一步凸显了肠道微生物群及其代谢物研究在HCC诊断标志物开发和新治疗策略制定中的潜在价值。

研究方法

本研究共收集了90名临床参与者的粪便与外周血样本以及他们的各项临床指标：32例NAFLD-HCC，28例NAFLD-肝硬化和30例无NAFLD对照。研究人员首先对比了参与者样本的临床信息，然后分别通过粪便宏基因组分析菌群失调表型与功能通路，通过粪便与血清代谢组学分析SCFAs及中间产物，通过利用体外菌群提取物进行免疫抑制表型分析，最后进行关联分析与调控模型构建。

研究结果

1）外周血免疫细胞定量与肠道菌群宏基因组测序在基线检查时，与NAFLD肝硬化组和非NAFLD对照组比较，NAFLD-HCC受试者的调节性T细胞(Tregs;CD3+CD4+CD25+Foxp3+)比例较高（P0.）。相反，NAFLD-HCC受试者的CD8+T细胞(CD3+CD8+)比例较低（P=0.）。上述结果表明NAFLD-HCC的受试者在基线时有外周免疫抑制。对受试者的粪便样品进行宏基因组测序，与非NAFLD对照组相比，Bacteroidesxylanisolvens(P=0.),Ruminococcusgnavus(P0.)和Clostridiumbolteae(P0.)等细菌在NAFLD-HCC和NAFLD-肝硬化中均显著富集（图d，e）。重要的是，Bacteroidescaecimuris（P0.）和Veillonellaparvula（P=0.）在NAFLD-HCC中显著富集（图e）。综上所述，NAFLD-HCC微生物群在五种细菌中富集（图2e），这些细菌都是SCFAs的生产者，且有研究报道该菌种具有免疫调节能力。2）NAFLD-HCC组的肠道菌群特征为了证实NAFLD-HCC组肠道菌群富含产生SCFA功能的菌种，研究人员测量了受试者粪便中负责SCFA合成的候选细菌基因的丰度。在此前的研究中，有21个候选基因在SCFA合成中起着重要作用，其中5个基因的丰度在各组间存在显著差异。重要的是，与NAFLD肝硬化和非NAFLD对照组相比，负责从丙酮酸产生草酰乙酸的丙酮酸羧化酶（pycA）在NAFLD-HCC中过度表达（P=0.）（图b）。此外，与NAFLD肝硬化和非NAFLD对照组相比，参与醋酸盐合成相关的基因（磷酸乙酰转移酶；pta）和丁酸/乙酰磷酸合成相关的基因（磷酸丁酰转移酶；ptb）在NAFLD-HCC中均过表达（P=0.和P=0.）（图b）。与非NAFLD对照组相比，丙酸合成途径中的两个基因，富马酸还原酶（frd）和琥珀酸辅酶A合成酶（sucC）在NAFLD-HCC微生物组中过度表达（P=0.和P=0.）（图b）。3）NAFLD-HCC组粪便和血清中SCFA及其中间产物的浓度升高研究者进一步对受试者粪便和血清样本进行了代谢组学检测和分析，在粪便样本中，用LC–MS/MS测定了65种在细菌代谢过程中重要的代谢物。草酰乙酸和乙酰磷酸是已知的SCFA中间体，与NAFLD肝硬化和非NAFLD对照组相比，NAFLD-HCC受试者的粪便中草酰乙酸和乙酰磷酸显著升高（分别为P0.和P=0.）（图a），异柠檬酸水平较低（P0.）。

使用1H-NMR对粪便和血清样本中的六种关键SCFA进行绝对定量。与NAFLD肝硬化和非NAFLD对照组相比，NAFLD-HCC受试者的粪便富含醋酸盐（P0.）、丁酸盐（P0.）和甲酸盐（P0.）（图b）；NAFLD-HCC受试者的血清中丁酸盐（P=0.）和丙酸盐（P=0.0）水平升高（图c）；两组间粪便中的丙二酸、丙酸或戊酸水平无显著差异。与非NAFLD对照组相比，NAFLD-HCC组和NAFLD肝硬化组的血清丙二酸均升高（P0.），但NAFLD-HCC组和NAFLD肝硬化组之间无差异（图4c）。综上所述，这些粪便和血清中SCFA的增加是NAFLD-HCC特异性的。

4）体外研究表明NAFLD-HCC微生物群可引起免疫抑制反应在分析完NAFLD-HCC受试者的微生物群组成和相关粪便代谢组学特征后，研究者进一步在体外细胞培养模型中研究微生物群对外周免疫应答的影响。他们发现，与非NAFLD对照单个细菌提取物（BE）相比，来自NAFLD-HCC受试者的BE诱导效应物IL-10+Treg（CD3+CD4+CD25+Foxp3+IL-10+）的扩增（P=0.）（图a）。相反，与NAFLD肝硬化和非NAFLD对照BE相比，NAFLD-HCC受试者的BE减弱了总CD8+T细胞（CD3+CD8+）的扩增（P=0.）（图b）。同样，与NAFLD肝硬化和非NAFLD对照BE相比，NAFLD-HCC受试者BE减弱了抗原递呈细胞(单核细胞、B细胞)的扩增（P=0.和P=0.）（图c,d）。5)NAFLD-HCC微生物群改变了促/抗炎细胞因子环境研究表明IL-2和IL-12（p70）在CD8+T细胞的扩增和活化中起重要作用。与NAFLD肝硬化和非NAFLD对照BE相比，NAFLD-HCC受试者BE抑制了这些促炎细胞因子的产生（P=0.和P=0.）。此外，与非NAFLD对照BE相比，NAFLD-HCC和NAFLD肝硬化均可抑制IL-4的产生（P0.）。与NAFLD肝硬化和非NAFLD对照BE相比，NAFLD-HCC诱导IL-6和抗炎细胞因子IL-10相应增加（P=0.和P=0.）。综上所述，NAFLD-HCC受试者的BE抑制了促炎性细胞因子的产生并诱导抗炎性细胞因子增加。

6)相关性分析

最后，研究者进行了相关分析，以评估NAFLD-HCC富集物种的丰度、粪便代谢物浓度和在体外模型中诱导的T细胞反应之间的关系。B.caecimuris、B.xylanisolvens和C.bolteae与效应因子IL-10+Tregs呈正相关（R=0.9，P=0.，R=0.66，P=0.，R=0.63，P=0.），B.caecimuris和B.xylanisolvens与CD8+T细胞呈负相关（R=?0.56，P=0.，R=?0.72，P=0.）。关于SCFAs及其中间产物，丁酸盐与Tregs（R=0.67，P=0.）和效应因子IL-10+Tregs（R=0.69，P=0.）之间存在正相关，这一发现支持了先前报道的体外研究，即丁酸盐可诱导PBMCs中的Treg群。此外，丁酸盐与细胞毒性CD8+T细胞呈负相关（R=?0.80，P=0.），再次强调了SCFA在调节外周免疫反应中的重要性。上述显著的相关性与研究者观察到的实验结果是相吻合的。

小结

肠道菌群及其代谢物被认为是肝脏疾病进展和HCC发生的辅助因子，它们通过肠道-肝脏轴与肝病/HCC患者的外周免疫免疫系统相互作用。本研究通过宏基因组和代谢组学研究，确定了NAFLD-HCC中富集的关键肠道菌种，其基因功能性和代谢组学证据表明这些菌群增加了短链脂肪酸合成，导致免疫抑制反应，而NAFLD肝硬化中未见上述现象。本研究进一步凸显了肠道菌群及其代谢物研究可能有助于发展HCC诊断标志物和新的治疗策略。